SHPORA.net :: PDA | |
Main FAQ гуманитарные науки естественные науки математические науки технические науки Билет №27. 1)Иммуноферментный анализ (ИФА). В основе этого метода лежит присоединение к анти-телам ферментной метки, что позволяет учитывать результат реакции антиген- антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня. В случае применения ИФА для поиска антигена, на стенках лунок адсорбируют соответст-вующие антитела. Исследуемый материал вносят в лунку, при этом антиген, взаимодействуя с антителами, фиксируется в ней. Лунки тщательно промывают буферным раствором, чтобы удалить не адсорбировавшиеся вещества. Затем вносят антитела против искомого антигена, меченные ферментом. Чаще всего в качестве фермента-метки используют пероксидазу хрена. После инкубации лунку снова промывают, чтобы удалить избыток меченных антител, если они не удерживаются комплексом антиген-антитело, образовавшимся на предыдущем этапе. На заключительном этапе в лунки вносят хромогенный субстрат (например, о- фенилендиамин). Ферментативное расщепление субстрата приводит к образованию окра-шенных продуктов реакции. Таким образом, изменение окраски содержимого лунки будет свидетельствовать о положительном результате реакции: взаимодействие антиген – антитело имело место. Иммуно-ферментный анализ или метод – выявление антигенов с помощью соответствующих им анти-тел, конъюгированных с ферментом- меткой. После соединения антигена с меченной фермен-том иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат-хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорцио-нальна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагно-стики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом мате-риале. При серодиагностике используются полистирольные планшеты, на стенках которых заранее с помощью тех или иных методов адсорбируется ("нагружается") антиген. Для предотвра-щения неспецифического связывания антител с полистиролом оставшаяся свободной по-верхность полистирола подвергается специальной обработке. Исследуемая сыворотка вно-сится в лунку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные ферментом. Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то они на данном этапе выступят в роли антигенов, с ко-торыми прореагируют меченные антитела. Добавление после промывки хромогенного суб-страта позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в лунках. Несомненным преимуществом иммуноферментного анализа перед классическими иммуно- логическими реакциями (реакция агглютинации, РСК, РНГА) является возможность количе-ственного анализа без использования серийных разведений. Интенсивность окраски в лунке пропорциональна количеству фермента, а следовательно количеству искомого ингредиента (антигена или антител). Измеряя оптическую плотность жидкости в лунке и сравнивая ее с контролем можно легко определить концентрацию искомого компонента. Еще одним досто-инством иммуноферментного анализа при серодиагностике является возможность определе-ния классов специфических антител (IgG, IgM, IgA), что имеет значение при определении фазы инфекционного процесса и его остроты. Радиоиммунный анализ (РИА) – один из методов количественного определения биологи-чески активных веществ в биологических жидкостях. Был изобретен в 1950-х годах прошлого столетия Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу. С его помощью ученые изучали клиренс инсулина у больных диабетом. В 1977 году за выдающийся вклад в развитие меди-цины Розалин Сасмен Ялоу была удостоена Нобелевской премии. Широкое признание и по-пулярность метод получил в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. РИА основывается на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им ме-ченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами, с после-дующей их детекцией на специальных счетчиках, так называемых, радиоспектрометрах. Та-ким образом, главное отличие радиоиммунного анализа от иммуноферментного анализа (ИФА) заключается в том, что вместо фермента антитело помечается изотопом. Как правило, для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп йода 125, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Диагностика посредством радиоиммунного анализа производится с целью обнаружения тех же самых заболеваний, что и при помощи иммуноферментного анализа (смотрите тему “Им-муноферментный анализ (ИФА)”). Радиоиммунный анализ обладает довольно высокой чувствительностью и специфичностью. Неоспоримым преимуществом РИА является возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении. Что касается недостатков, то они, как правило, связываются с ограничениями, определяемыми режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно коротким сроком годности диагностического набора, что связа-но с распадом радиоактивной метки. Кроме того, диагностика посредством радиоиммунного анализа предусматривает наличие специализированной лаборатории, а также использование дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков). Иммуноблоттинг (син. вестернблоттинг) - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг - от англ, blot, пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нит-роцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с "блотами" антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкуба-ции, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуногло-булинов человека, меченную ферментом (3). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента. Таким образом, выявляются непосредственно белки вируса, который не только давно выде-лен и сфотографирован, а ещё и является одним из наиболее изученных. 2)Для исследования берут кровь,биоптаты печени и проводят экспресс- методы:*иммунохимический (иммунопреципитация в геле, РНГА, ИФА, РИА) *малекулярно-биологический (ПЦР, ДНК-зондов) и серологические МИ. В сыворотке крови обнаруживаются HBsAg-это поверхностный АГ HBV,который маркирует инфицированность вирусом гепатита, и (HBeAg в незначительных количествах -это ядерный «е»- АГ виру-са,указывающий на реплекацыю вируса в гепатоцитах,высокую инфекционность крови и вы-сокий риск перинатальной передачи вируса.) IgM анти- HBc-это АТ класса М к ядерному АГ,один из наиболее ранних сывороточных маркёров ГВ, который указывает на острую ин-фекцию,при хр гВ маркирует репликацию НВV и активность процесса в печени. При обост-рении хр ГВ будут обнаруживаться HBcAg- это ядерный «core» АГ вируса,который маркирует репликацию вируса в гепатоцитах,обнаруж-ся только при морфологическом исследовании биоптатов печени и на аутопсии,а в свободном виде в крови не выявляется. Так же АТ к «е» АГ- указывают на начало реконвалесценции, 3) Бифидумбактерин сухой. Состав. Бифидумбактерин сухой представляет собой лиофильно высушенную в среде куль-тивирования во флаконах, ампулах или спрессованную в таблетку микробную массу живых, антагонистически активных штаммов Bifidobakterium bifidum № 1, 791 или ЛВА-3. Препарат имеет вид пористой или кристаллической массы бежевого или беловато-серого цвета. Выпускается в виде биомассы, лиофилизированной во флаконах по 5 доз, в ампулах по 2 дозы и в таблетках по 10—20 штук ко флаконах или упаковке «Сервак» по 24 таблетки. Каж-дая таблетка — одна доза препарата. Назначение. Препарат предназначен для лечения детей и с взрослых при дисбактериозах кишечника, кишечных инфекциях, диарее и запорах, интоксикации, после длительного при-менения антибиотиков и противоопухолевых препаратов, радиационного облучения. Способ применения и дозировка. Бифидумбактерин при кишечных заболеваниях применя-ют через рот, а в акушерско-гинекологической практике интравагинально в форме свечей. Содержимое флакона (ампулы) растворяют кипяченой водой комнатной температуры из рас-чета: 1 чайная ложка на 1 дозу препарата. Необходимое количество доз выпивают за 20—30 минут до еды. Грудным детям препарат можно давать перед кормлением. При кишечных заболеваниях детям первого полугодия жизни препарат назначают по 3 дозы на прием 3 раза в день. Детям второго полугодия и старше — по 5 доз 2 раза в день. Детям при сепсисе, пневмонии и других гнойно-инфекционных заболеваниях назначают по 2—3 дозы 3 раза в день в комплексе с общепринятыми методами лечения основного заболе-вания. При возникновении у данной группы детей нарушений функции желудочно-кишечного тракта и угрозы язвенно-некротического энтероколита дозировку бифидумбактерина увеличивают до 10 доз в сутки. При острых и хронических воспалительных заболеваниях тонкого и толстого кишечника, ко-литах и энтероколитах у взрослых рекомендуется по 5 доз 2—3 раза в день. Длительность курса лечения бифидумбактерином определяется тяжестью клинических проявлений, возрас-том больного и составляет 2—4 неделя, а в отдельных случаях—до 3 месяцев. С профилактической целью назначают по 5 доз 1-2 раза в день в течение 1-2 недель. Реакция на введение. Применение бифидумбактерина не должно вызывать реакций. Противопоказания для применения препарата отсутствуют. |