SHPORA.net :: PDA | |
Main FAQ гуманитарные науки естественные науки математические науки технические науки Билет №26. 1) Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями ( флуоресцеинизотиоцианат , ро-дамин, В-изотицианит , лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакцион-но-способные группы ( сульфохлорид , изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со сво-бодными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ-АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микро-скопом (рис. 7). С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой метод. Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и иден-тификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале. Аг + АТ + электролит = светящийся в УФ - лучах комплекс Микроб сыворотка, меченная флюорохромом Часто используют краситель изотиоционат флюоресциина - ФИТЦ При исследовании этим методом используют люминесцентный микроскоп. Постановка Р И Ф На мазок наносят 30 мкл раствора ФИТЦ-меченных антител. Помещают стекло во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в течение 20-25 мин, или в термостате при 37° С в течение 15 мин. Промывают стекло в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. На высушенный мазок наносят каплю монтирующей жидкости, мазок накрывают покровным стеклом и микроскопируют с использованием люминесцентного микроскопа или люминес-центной насадки к обычному оптическому микроскопу. Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым антителом. Непрямой метод - на поэтапном выявлении комплекса АГ-АТ с помощью флуоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап - в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином . Преимущество РИФ - простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чу-мы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминес-центный микроскоп. Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом ма-териале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверх-ность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональые анти-тела (в случае непрямой РИФ, сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем меченными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяет-ся от другого промывкой. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оп-тическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освеще-ние препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оцени-вает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение. Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой ва-риант этой реакции может быть использован как для обнаружения антигена, так и для серо-диагностики (например, при болезни Лайма, сифилисе). В этом случае готовят мазки из эта-лонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присут-ствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченной сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положи-тельного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблю-дают специфическое свечение эталонной культуры. Основным недостатком РИФ является ее субъективность. Классическими критериями специфичности этой реакции являются: -характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке; -периферический характер свечения объекта; -цвет флюоресценции; -интенсивность флюоресценции. При исследовании крупных объектов (трихомонады, гарднереллы, клетки пораженные виру-сами) эти критерии позволяют получить высокодостоверный результат. В то же время, эле-ментарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на пределе разрешаю-щей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка морфологии микроорга-низмов затруднена, а свечение теряет периферический характер. Остающихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации наблюдаемого микроорганизма. В связи с вы-шесказанным, субъективный характер учета реакции предъявляет особые требования к ква-лификации персонала проводящего исследования. 2)Заражение алиментарным путём. Указывают на гепатит А: работает продавцом на овощ-ном рынке, правила гигиены соблюдает не всегда, иногда ест немытые фрукты. Исключают другие вирусные гепатиты: За последние полгода парентеральных вмешательств, посещений стоматолога и гинеколога не было. внебрачные связи отрицает. Ранее гепатитом не болела. Для подтверждения диагноза надо взять кровь, где обнаруживаются АТ к вирусу гепатита класса М( анти-НАV IgМ или анти-ВГА IgМ)- иммуноферментного анализа (ИФА) в сыво-ротке крови с первых дней болезни и далее в течение 3–6 мес. А так же повышение в крови билирубина и печёночных ферментов аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аланинами-нотранспептидазы (АсАТ), высокий показатель тимоловой пробы. 3) Бруцеллин (brucellinum) — фильтрат 30-дневной бульонной культуры трех типов бру-целл, применяемый в качестве аллергена для диагностики и специфического лечения бру-целлеза. |