SHPORA.net :: PDA

Login:
регистрация

Main
FAQ

гуманитарные науки
естественные науки
математические науки
технические науки
Search:
Title: | Body:

Билет №21.




1) Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических

исследовани-ях у больных и здоровых животных. С этой целью применяют

серологические методы (от лат serum - сыворотка и logos - учение), т. е. методы

изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген - антитело, определяемых

в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических

реак-ций в лабораториях. Реакция invitroмежду антигеном и антителом состоит из

специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое

специфическое свя-зывание активного центра антитела с детерминантой антигена.

Затем наступает неспецифи-ческая фаза — более медленная, которая проявляется

видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен

агглютинации) или преципитата в виде помутне-ния. Эта фаза требует наличия

определенных условий (электролитов, оптимального рН сре-ды).

Связывание детерминанты антигена (эпито-па) с активным центром Fab-фрагмента

антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и

гидрофобным взаимо-действием. Прочность и количество связавшегося антигена

антителами зависят от аф-фин­ности, авидности антител и их валентности.

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях

у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от

лат. serum— сыворотка и logos— учение), т. е. методы изучения антител и

антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и

других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя

позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также

для идентифи-кации антигенов микробов, различных биологически активных веществ,

групп крови, ткане-вых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов

клеток и др.

При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем

изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т.

е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические

антитела. Это так на-зываемая серологическая идентификация микроорганизмов.

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации,

преципита-ции, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием

меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный,

иммунофлюорес-центный мето-ды). Перечисленные реакции различаются по

регистрируемому эффекту и технике постанов-ки, однако, все они основаны на

реакции взаимодействия антигена с антителом и применя-ются для выявления как

антител, так и антигенов. Реакции иммунитета характеризуются вы-сокой

чувствительностью и специфичностью.

Для определения антител или антигенов применяют следующие реакции антиген—

антитело: реакция агглютинации; реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации;

реакция коагглютинации; реакция Кумбса; реакция торможения гемагглютинации;

реакция преципитации; реакция нейтрализации; реакция связывания комплемента;

реакция радиаль-ного гемолиза; реакция иммуного прилипания; реакция

иммунофлюоресценции; иммуно-ферментный анализ; радиоиммунный метод, или анализ;

иммуноблоттинг; иммунная элек-тронная микроскопия.

РЕАКЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕЧЕННЫХ АТ И Аг

Реакции с использованием меченных антител и антигенов составляют основу методов

экс-пресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное

содержание Аг и АТ в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть

использованы различные ферменты, красители флюорохромы и изотопы.

Реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, или метод Кунса). Различают три разновидности

ме-тода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом

экспресс-

диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные

им-мунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны

светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа (рис. 7.61). Бактерии в мазке,

обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в

виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген—антитело с помощью

а нти глобул и новой (против антител) сыворотки, меченной флюорохромом. Для

зтого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей

диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов,

отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок а нти

глобул и новой {антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами (рис. 7.62).

В результате образуется комплекс микроб + анти- микробные кроличьи антитела +

антикроличьи антитела, мечененные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в

люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.





Иммуноферментный анализ или метод — выявление антигенов с помощью соответст-

вующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-

га-лактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной

ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат

расщепляется фер-ментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность

окраски прямо пропорцио-нальна количеству связавшихся молекул антигена и

антител. ИФА применяют для диагно-стики вирусных, бактериальных и паразитарных

болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также

определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически

активных веществ, содержащихся в исследуемом мате-риале в минорных

концентрациях A010-10|? г/л).

Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции

(ан-тиген или антитело ) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках

планшеток из поли-стирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или

антигенов. При положи-тельном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз

после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты

путем промывания.

I. При определении антител {рис. 7.63) в лунки планшеток с сорбированным

антигеном по-следовательно добавляют сыворотку крови больного, анти глобул и

новую сыворотку, ме-ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

IT. При определении антигена (рис, 7.64) в лунки с сорбированными антителами

вносят ан-тиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют

диагностическую сыво-ротку против него и вторичные антитела (против

диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для

фермента. Конкурентный ИФА для определения антигенов (рис. 7.65). Конкурентный

ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела

конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.



2) Возбудителями холеры являются два биовара холерного вибриона — классический

(Vibrio cholerae biovar cholerae) и Эль-Тор (Vibrio cholerae biovar eltor).,

которые относятся к сем. Vibrionаceae. Холера — острое инфекционное заболевание,

характеризующееся общей интоксикацией организма и острым гастроэнтеритом.

Чрезвычайно важна быстрая лабора-торная диагностика холеры, так как первые

случаи заболевания требуют бактериологическо-го подтверждения для своевременного

принятия эффективных противоэпидемических меро-приятий. Лабораторная диагностика

холеры проводится путем бактериоско-пического и бак-териологического

исследований. Трудности диагностики связаны с дифференциацией биоваров холерных

вибрионов от сходных с ними холероподобных вибрионов (Мечни-кова, Финклера,

Приора и др.), широко распространенных в природе и непатогенных для человека.

Материал для исследования: испражнения больного с подозрением на холеру, а)

микроско-пировать готовые мазки из исследуемой культуры; б) определить

подвижность культуры, выращенной на щелочной пептонной воде; в) отметить

результаты развернутой реакции агг-лютинации с О-противохолерной сывороткой; г)

отметить наличие или отсутствие роста ис-следуемой культуры на среде с

полимиксином и результаты гексаминового теста. Дать за-ключение по проведенным

исследованиям.

Бактериоскопическое исследование (схема 13). Из исследуемого материала

(испражнения, рвотные массы) готовят мазки, окрашивают по Граму и водным

фуксином. Кроме того, из нативного материала готовят препарат «висячая» капля, в

котором определяют наличие под-вижных вибрионов при обычной или фазово-

контрастной микроскопии. Обнаружение в маз-ках большого количества

грамотрицательных, слегка изогнутых палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и

активноподвижных вибрионов в препарате «висячая» капля позволяет дать первый

предварительный положительный ответ .

Бактериологическое исследование. Материал засевают в различные жидкие и на

плотные питательные среды, в частности, во флаконы со щелочной пептонной водой

(1% пептонная вода, 0,5% хлорида натрия, 0,01% KNOa и 0,2% Na2C03; рН 9,0), на

чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пептонной воде инкубируют при

37°С в течение 5—6 ч, на чашках — 10—12 ч. Из пленки, образующейся на пептонной

воде, или из поверхностного слоя делают мазки и препараты «раздавленная» и

«висячая» капля. Этот же материал ис-пользуется для постановки реакции

агглютинации на стекле со специфической противохо-лерной О-сывороткой. Часть

пептонной воды переносят в другую пробирку для постановки нитрозоиндоловой

пробы. Для этого добавляют несколько капель серной кислоты. В по-ложительном

случае появляется розовое окрашивание вследствие образования нитрозо-индола (из

индола и нитритов, которые образуются под влиянием холерного вибриона).

Независимо от результатов исследования делают пересев на вторую пептонную воду.

Нали-чие грамотрицательных вибрионов, агглютинирующихся О-сывороткой, позволяет

дать второй предварительный ответ. Независимо от полученных результатов

продолжают исследование, как показано.

Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят по 5-6 однотипным

колониям, выросшим на щелочном агаре. Для ускорения хода анализа ставят

развернутую реакцию агглютинации с бактериальной суспензией, приготовленной из

колоний. Для этого -агглютинирующую О-сыворотку разводят в пробирках до титра

пептонной водой (в объеме 0,5 мл). Затем в каждую пробирку вносят 1—2 капли

суспензии бактерий. Результат реакции агглютинации учитывают после 3-4-часовой

инкубации при 37°С. Окончательную иденти-фикацию культуры проводят на основании

определения чувствительности выделенных куль-тур к холерному фагу, их

гемолитических свойств, биохимической активности и агглютина-бельности

противохолерной О-сывороткой и типовыми агглютинирующими сыворотками Инаба и

Огава . Таким образом, идентификацию культур проводят в три этапа: 1) устанавли-

вают их принадлежность к роду Vibrio; 2) дифференцируют их от холероподобных

виб-рионов в реакции агглютинации с О-сывороткой, по чувствительности к

специфиче-скому фагу и другими тестами; 3) определяют видовые признаки культур .

Окончательное заключение о выделении и дифференцировании холерных вибрионов дают

через 36—48 ч на основании комплексного изучения основных биологических

признаков возбудителя.

Трудности при оценке результатов бактериологического исследования встречаются

при вы-делении атипичных холерных вибрионов и в первую очередь не

агглютинирующихся холер-ной О-сывороткой (НАГ-вибрионы). НАГ-вибрионы могут

лизироваться одним из специфи-ческих холерных фагов и обладать другими

свойствами, сходными с холерными вибрионами.

Ускоренные методы обнаружения холерных вибрионов.

1.Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами.

Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают

холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными

фагами. Готовят из них препараты <<раздавленная» капля, которые исследуют в

микроскопе, снабженном темнопольным или фазово-контрастным устройством. В

положительном случае через 3-5.-мин движение вибрионов прекращается.

2. Иммунофлюоресцентный метод. Препараты из исследуемого материала обрабатывают

флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микро-

скопе. Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже

единичных вибрионов с ярким желто-зеленым, свечением в виде блестящего ободка по

периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1—2 ч после

начала исследования при концентрации вибрионов не менее 106 клеток в 1 мл,

поэтому рекомендуется предвари-тельное подращивание материала на питательных

средах.

Серодиагностика. Серологическое исследование является вспомогательным и

применяется для ретроспективной диагностики холеры, выявления вибриононосителей

и оценки напря-женности постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Для

этого обычно ставят реакцию агглютинации или РПГА, а также определяют

вибриоцидные антитела в реакции лизиса in vitro.



3) Вакцина клещевого энцефалита культуральная сорбированная инактивированная

жидкая.

Состав. Вакцина содержит стерильную взвесь инактивированного формалином вируса

кле-щевого энцефалита, полученного путем репродукции его во взвеси клеток

эмбрионов курицы, сорбированного на гидроокиси алюминия. Должна иметь цвет от

розово-красного до красного.

Выпускается в жидкой форме в 2 мл ампулах, доза — 1 мл.

Назначение — для активной профилактики в выработки иммунитета к вирусу

клещевого энцефалита, а также для вакцинации доноров с целью получения

специфического иммуног-лобулина и иммунной плазмы для профилактики и лечения

клещевого энцефалита.

Способ введения и дозировка. Первичный курс вакцинации состоит из трех инъекций

пре-парата. Первые две проводят н ноябре—декабре, вторую — через 14—30 сут после

верной, третью — через 3 мес после второй (март — апрель), не позднее чем за 14

сут до посещения очага инфекции.

Для экстренной профилактики проводится двукратная вакцинация с интервалом от 30

до 60 сут. Последняя прививка должна быть проведена не позднее чем за 14 сут до

выхода в очаг инфекции.

Ежегодно необходимо проводить на протяжении 3 лет однократную ревакцинацию, но

не позже 14 суток до выхода в очаг. Если пропущены одна из ежегодных

ревакцинаций, допус-кается продолжение прививок, по выше указанной схеме, если

пропущены две ревакцинации, курс прививок проводят заново. Доза препарата для

детей 4-6 лет – 0,5 мл на инъекцию, для детей старше 6 лет и взрослых – 1 мл.

Вакцину вводят подкожно у нижнего угла лопатки.

Прививочные реакции. Вакцина вызывает кратковременное ощущение жжения, иногда

от-мечаются местные реакции в виде покраснения, болезненности, инфильтрата в

месте введе-ния. Продолжительность не превышает 5 суток. Общие реакции

продолжаются не более 3 су-ток и выражаются в повышении температуры, головной

боли, недомогания.

Противопоказания – острые инфекционные и неинфекционные заболевания, туберкулез

и ревматизм в активной форме, наследственные, дегенеративные о прогрессирующие

заболе-вания нервной системы, эпилепсия, аллергические реакции, хронические

заболевания печени и почек, сердечно-сосудистая недостаточность 2 и 3 степени,

перенесенные инфаркт миокар-да и инсульт, диабет и др эндокринные нарушения,

злокачественные новообразования, бо-лезнь крови, беременность.