SHPORA.net :: PDA | |
Main FAQ гуманитарные науки естественные науки математические науки технические науки Билет №21. 1) Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследовани-ях у больных и здоровых животных. С этой целью применяют серологические методы (от лат serum - сыворотка и logos - учение), т. е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген - антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических реак-ций в лабораториях. Реакция invitroмежду антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое свя-зывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифи-ческая фаза — более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутне-ния. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН сре-ды). Связывание детерминанты антигена (эпито-па) с активным центром Fab-фрагмента антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо-действием. Прочность и количество связавшегося антигена антителами зависят от аф-финности, авидности антител и их валентности. Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum— сыворотка и logos— учение), т. е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентифи-кации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, ткане-вых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др. При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это так на-зываемая серологическая идентификация микроорганизмов. В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципита-ции, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюорес-центный мето-ды). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постанов-ки, однако, все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применя-ются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммунитета характеризуются вы-сокой чувствительностью и специфичностью. Для определения антител или антигенов применяют следующие реакции антиген— антитело: реакция агглютинации; реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации; реакция коагглютинации; реакция Кумбса; реакция торможения гемагглютинации; реакция преципитации; реакция нейтрализации; реакция связывания комплемента; реакция радиаль-ного гемолиза; реакция иммуного прилипания; реакция иммунофлюоресценции; иммуно-ферментный анализ; радиоиммунный метод, или анализ; иммуноблоттинг; иммунная элек-тронная микроскопия. РЕАКЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕЧЕННЫХ АТ И Аг Реакции с использованием меченных антител и антигенов составляют основу методов экс-пресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и АТ в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители флюорохромы и изотопы. Реакция иммунофлюоресценции Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, или метод Кунса). Различают три разновидности ме-тода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс- диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные им-мунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа (рис. 7.61). Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген—антитело с помощью а нти глобул и новой (против антител) сыворотки, меченной флюорохромом. Для зтого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок а нти глобул и новой {антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами (рис. 7.62). В результате образуется комплекс микроб + анти- микробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, мечененные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе. Иммуноферментный анализ или метод — выявление антигенов с помощью соответст- вующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета- га-лактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется фер-ментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорцио-нальна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагно-стики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом мате-риале в минорных концентрациях A010-10|? г/л). Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (ан-тиген или антитело ) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из поли-стирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положи-тельном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания. I. При определении антител {рис. 7.63) в лунки планшеток с сорбированным антигеном по-следовательно добавляют сыворотку крови больного, анти глобул и новую сыворотку, ме-ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента. IT. При определении антигена (рис, 7.64) в лунки с сорбированными антителами вносят ан-тиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыво-ротку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента. Конкурентный ИФА для определения антигенов (рис. 7.65). Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе. 2) Возбудителями холеры являются два биовара холерного вибриона — классический (Vibrio cholerae biovar cholerae) и Эль-Тор (Vibrio cholerae biovar eltor)., которые относятся к сем. Vibrionаceae. Холера — острое инфекционное заболевание, характеризующееся общей интоксикацией организма и острым гастроэнтеритом. Чрезвычайно важна быстрая лабора-торная диагностика холеры, так как первые случаи заболевания требуют бактериологическо-го подтверждения для своевременного принятия эффективных противоэпидемических меро-приятий. Лабораторная диагностика холеры проводится путем бактериоско-пического и бак-териологического исследований. Трудности диагностики связаны с дифференциацией биоваров холерных вибрионов от сходных с ними холероподобных вибрионов (Мечни-кова, Финклера, Приора и др.), широко распространенных в природе и непатогенных для человека. Материал для исследования: испражнения больного с подозрением на холеру, а) микроско-пировать готовые мазки из исследуемой культуры; б) определить подвижность культуры, выращенной на щелочной пептонной воде; в) отметить результаты развернутой реакции агг-лютинации с О-противохолерной сывороткой; г) отметить наличие или отсутствие роста ис-следуемой культуры на среде с полимиксином и результаты гексаминового теста. Дать за-ключение по проведенным исследованиям. Бактериоскопическое исследование (схема 13). Из исследуемого материала (испражнения, рвотные массы) готовят мазки, окрашивают по Граму и водным фуксином. Кроме того, из нативного материала готовят препарат «висячая» капля, в котором определяют наличие под-вижных вибрионов при обычной или фазово- контрастной микроскопии. Обнаружение в маз-ках большого количества грамотрицательных, слегка изогнутых палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и активноподвижных вибрионов в препарате «висячая» капля позволяет дать первый предварительный положительный ответ . Бактериологическое исследование. Материал засевают в различные жидкие и на плотные питательные среды, в частности, во флаконы со щелочной пептонной водой (1% пептонная вода, 0,5% хлорида натрия, 0,01% KNOa и 0,2% Na2C03; рН 9,0), на чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пептонной воде инкубируют при 37°С в течение 5—6 ч, на чашках — 10—12 ч. Из пленки, образующейся на пептонной воде, или из поверхностного слоя делают мазки и препараты «раздавленная» и «висячая» капля. Этот же материал ис-пользуется для постановки реакции агглютинации на стекле со специфической противохо-лерной О-сывороткой. Часть пептонной воды переносят в другую пробирку для постановки нитрозоиндоловой пробы. Для этого добавляют несколько капель серной кислоты. В по-ложительном случае появляется розовое окрашивание вследствие образования нитрозо-индола (из индола и нитритов, которые образуются под влиянием холерного вибриона). Независимо от результатов исследования делают пересев на вторую пептонную воду. Нали-чие грамотрицательных вибрионов, агглютинирующихся О-сывороткой, позволяет дать второй предварительный ответ. Независимо от полученных результатов продолжают исследование, как показано. Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят по 5-6 однотипным колониям, выросшим на щелочном агаре. Для ускорения хода анализа ставят развернутую реакцию агглютинации с бактериальной суспензией, приготовленной из колоний. Для этого -агглютинирующую О-сыворотку разводят в пробирках до титра пептонной водой (в объеме 0,5 мл). Затем в каждую пробирку вносят 1—2 капли суспензии бактерий. Результат реакции агглютинации учитывают после 3-4-часовой инкубации при 37°С. Окончательную иденти-фикацию культуры проводят на основании определения чувствительности выделенных куль-тур к холерному фагу, их гемолитических свойств, биохимической активности и агглютина-бельности противохолерной О-сывороткой и типовыми агглютинирующими сыворотками Инаба и Огава . Таким образом, идентификацию культур проводят в три этапа: 1) устанавли- вают их принадлежность к роду Vibrio; 2) дифференцируют их от холероподобных виб-рионов в реакции агглютинации с О-сывороткой, по чувствительности к специфиче-скому фагу и другими тестами; 3) определяют видовые признаки культур . Окончательное заключение о выделении и дифференцировании холерных вибрионов дают через 36—48 ч на основании комплексного изучения основных биологических признаков возбудителя. Трудности при оценке результатов бактериологического исследования встречаются при вы-делении атипичных холерных вибрионов и в первую очередь не агглютинирующихся холер-ной О-сывороткой (НАГ-вибрионы). НАГ-вибрионы могут лизироваться одним из специфи-ческих холерных фагов и обладать другими свойствами, сходными с холерными вибрионами. Ускоренные методы обнаружения холерных вибрионов. 1.Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты <<раздавленная» капля, которые исследуют в микроскопе, снабженном темнопольным или фазово-контрастным устройством. В положительном случае через 3-5.-мин движение вибрионов прекращается. 2. Иммунофлюоресцентный метод. Препараты из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микро- скопе. Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым, свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1—2 ч после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 106 клеток в 1 мл, поэтому рекомендуется предвари-тельное подращивание материала на питательных средах. Серодиагностика. Серологическое исследование является вспомогательным и применяется для ретроспективной диагностики холеры, выявления вибриононосителей и оценки напря-женности постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Для этого обычно ставят реакцию агглютинации или РПГА, а также определяют вибриоцидные антитела в реакции лизиса in vitro. 3) Вакцина клещевого энцефалита культуральная сорбированная инактивированная жидкая. Состав. Вакцина содержит стерильную взвесь инактивированного формалином вируса кле-щевого энцефалита, полученного путем репродукции его во взвеси клеток эмбрионов курицы, сорбированного на гидроокиси алюминия. Должна иметь цвет от розово-красного до красного. Выпускается в жидкой форме в 2 мл ампулах, доза — 1 мл. Назначение — для активной профилактики в выработки иммунитета к вирусу клещевого энцефалита, а также для вакцинации доноров с целью получения специфического иммуног-лобулина и иммунной плазмы для профилактики и лечения клещевого энцефалита. Способ введения и дозировка. Первичный курс вакцинации состоит из трех инъекций пре-парата. Первые две проводят н ноябре—декабре, вторую — через 14—30 сут после верной, третью — через 3 мес после второй (март — апрель), не позднее чем за 14 сут до посещения очага инфекции. Для экстренной профилактики проводится двукратная вакцинация с интервалом от 30 до 60 сут. Последняя прививка должна быть проведена не позднее чем за 14 сут до выхода в очаг инфекции. Ежегодно необходимо проводить на протяжении 3 лет однократную ревакцинацию, но не позже 14 суток до выхода в очаг. Если пропущены одна из ежегодных ревакцинаций, допус-кается продолжение прививок, по выше указанной схеме, если пропущены две ревакцинации, курс прививок проводят заново. Доза препарата для детей 4-6 лет – 0,5 мл на инъекцию, для детей старше 6 лет и взрослых – 1 мл. Вакцину вводят подкожно у нижнего угла лопатки. Прививочные реакции. Вакцина вызывает кратковременное ощущение жжения, иногда от-мечаются местные реакции в виде покраснения, болезненности, инфильтрата в месте введе-ния. Продолжительность не превышает 5 суток. Общие реакции продолжаются не более 3 су-ток и выражаются в повышении температуры, головной боли, недомогания. Противопоказания – острые инфекционные и неинфекционные заболевания, туберкулез и ревматизм в активной форме, наследственные, дегенеративные о прогрессирующие заболе-вания нервной системы, эпилепсия, аллергические реакции, хронические заболевания печени и почек, сердечно-сосудистая недостаточность 2 и 3 степени, перенесенные инфаркт миокар-да и инсульт, диабет и др эндокринные нарушения, злокачественные новообразования, бо-лезнь крови, беременность. |